淺談?dòng)糜趶V東蔬菜有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)的幾種生物識(shí)別酶
廣東作為我國(guó)蔬菜出口的一枝獨(dú)秀，但有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥的施用也對(duì)廣東蔬菜的發(fā)展提出了挑戰(zhàn)，使其有機(jī)磷農(nóng)藥殘留速測(cè)技術(shù)具有重要的應(yīng)用意義。當(dāng)前色譜法雖然分析精度高、定量準(zhǔn)確，但樣品的前處理復(fù)雜、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、需要技術(shù)熟練的操作人員，不適合市場(chǎng)管理部門(mén)經(jīng)常性的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。開(kāi)發(fā)和推廣適合我國(guó)產(chǎn)品產(chǎn)銷(xiāo)特點(diǎn)的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)成為控制當(dāng)前農(nóng)藥殘留的關(guān)鍵技術(shù)措施。農(nóng)藥殘留檢測(cè)中常用到土壤分析儀來(lái)測(cè)定土壤中氮、磷的含量，從而確定是否施用了農(nóng)藥。
一、乙酰膽堿酯酶
(一)分布及生化特性
乙酰膽堿酯酶被稱(chēng)為真性或特異性膽堿酯酶，主要存在于哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞及神經(jīng)組織中，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)節(jié)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)板及發(fā)電器官中，是維持體內(nèi)正常神經(jīng)功能的非常重要的一類(lèi)水解酶。膽堿酯受膽堿酯酶水解首先形成一個(gè)Michaelis 酶—底物絡(luò)和物，接著�；D(zhuǎn)移到酯酶分子上去，形成酰化酯酶，最后迅速水解，使酶失活的催化作用來(lái)自酶蛋白分子本身的結(jié)構(gòu)，不需任何特異性輔基或金屬離子參與。另一催化底物水解過(guò)程，為酯動(dòng)部位或催化部位。以含有一個(gè)陽(yáng)離子基的酯作為底物，其活性區(qū)里有一個(gè)陰離子部位，以便吸引和連接底物，使其易于受酯動(dòng)部位的進(jìn)攻。
(二)作用機(jī)制及應(yīng)用情況
有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)化合物是乙酰膽堿酯酶的抑制劑，通過(guò)與活性位點(diǎn)的絲氨酸（Ser200）殘基形成共價(jià)鍵而抑制乙酰膽堿酯酶的活性，選擇合適的底物，根據(jù)有機(jī)磷對(duì)該酶的抑制程度不同而影響產(chǎn)物的量，通過(guò)比色法可測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量。目前，廣州、深圳、珠海、惠州、香港等城市都已把農(nóng)藥速測(cè)卡作為常規(guī)的檢測(cè)方法，采用的即為對(duì)農(nóng)藥高度敏感的膽堿酯酶和顯色劑做成的酶試紙。國(guó)內(nèi)由于技術(shù)等方面原因難以實(shí)現(xiàn)乙酰膽堿酯酶純品的大量制備，從來(lái)源豐富的羅非魚(yú)頭部提取乙酰膽堿酯酶粗酶液，通過(guò)檢測(cè)酶活性及對(duì)不同濃度農(nóng)藥的抑制率及與標(biāo)準(zhǔn)方法的對(duì)比試驗(yàn)，得出此粗酶液可用于快速檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥殘留，可為基層單位提供一個(gè)應(yīng)急、簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段。同時(shí)果蠅的敏感頭部也是乙酰膽堿酯酶的重要來(lái)源，我國(guó)農(nóng)業(yè)部曾對(duì)酶抑制快速檢測(cè)法的幾個(gè)關(guān)鍵步驟進(jìn)行反復(fù)的比較試驗(yàn)，對(duì)敏感家蠅頭乙酰膽堿酯酶與有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行了敏感度的試驗(yàn)。
二、丁酰膽堿酯酶
(一)分布及生化特性
血清丁酰膽堿酯酶是由四個(gè)亞基組成的糖蛋白，分子量28 萬(wàn)～35 萬(wàn)。作為一類(lèi)糖蛋白，主要存在于腦、肝、血及膽堿能神經(jīng)末稍的突觸間隙中，主要由肝臟合成，并存在于血清中，生理作用不明，稱(chēng)為假性膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶Lockridge 等采用Edman 降解法測(cè)定了人血清BChE 完整的氨基酸序列，共含有574 個(gè)氨基酸殘基。BChE 氨基酸序列與其他酯酶家族蛋白有很高的同源性。以電鰩AChE 的三維結(jié)構(gòu)為模板對(duì)人BChE 的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果表明，BChE 活性中心，囊袋的底部為Ser198，其兩側(cè)相距一定距離分別是�；Y(jié)合部位和膽堿結(jié)合部位。研究發(fā)現(xiàn)人BChE 的氨基酸序列上有Zn2+ 離子結(jié)合結(jié)構(gòu)。
(二)作用機(jī)制及應(yīng)用情況
丁酰膽堿酯酶能與有機(jī)磷毒劑或殺蟲(chóng)劑結(jié)合，并能水解許多酯類(lèi)、肽類(lèi)及酰胺類(lèi)化合物，對(duì)這些化合物的中毒具有防治作用。目前應(yīng)用較為廣泛的為用于體外定量測(cè)定人血清或其他體液中膽堿酯酶的活力。測(cè)定血清膽堿酯酶活性是協(xié)助診斷有機(jī)磷中毒和評(píng)估實(shí)質(zhì)細(xì)胞損害的重要手段，有機(jī)磷通過(guò)與活性位點(diǎn)的絲氨酸（Ser200）殘基形成共價(jià)鍵而抑制酯酶的活性。
三、植物膽堿酯酶
(一)分布及生化特性
植物膽堿酯酶是酯酶- B 中的一種膽堿酯酶，其對(duì)有機(jī)磷酸酯分子敏感，通常稱(chēng)為絲氨酸水解酶、脂族酯酶或非特異性酯酶，廣泛存在于植物體內(nèi)，不同植物種類(lèi)和生長(zhǎng)期其含量不同。雖然植物中的膽堿酯酶活性比乙酰膽堿酯酶的活性略低，但其來(lái)源豐富、成本低，開(kāi)始受到國(guó)內(nèi)學(xué)者的關(guān)注。
(二)作用機(jī)制及應(yīng)用情況
植物膽堿酯酶可以使a- 乙酸萘酯水解為萘酚和乙酸，萘酚與顯色劑固藍(lán)B 鹽作用形成紫紅色的偶氮化合物，利用該原理測(cè)定該物質(zhì)的吸光度值變化既可知酶的活性大小。周艷明等從蕎麥面粉中提取得到植物酯酶，粗酶經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、Q- Sepharose Fast Flow 離子交換柱層析后酶活可提純16.814 倍，純酶液經(jīng)Sephadex G- 200 層析和HPLC 分析證明為單一物質(zhì)[2]，阮長(zhǎng)青等從小麥中提取了植物酯酶，并進(jìn)行了其催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特性、以及抑制有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)的定性、定量研究。由于酶特性及抑制作用發(fā)生在特定條件下，各種外源干擾可能對(duì)酶活性及抑制作用程度帶來(lái)影響，采用相應(yīng)方法建立有機(jī)磷農(nóng)藥與酶的抑制關(guān)系時(shí)，會(huì)引起檢測(cè)的靈敏度下降、抑制曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍較窄、檢出下限較高的問(wèn)題，但對(duì)于廣東農(nóng)殘現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求量較大的狀況而言，植物酯酶檢測(cè)具有快速、便捷、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)，不失為熱點(diǎn)開(kāi)發(fā)的方法。
四、結(jié)論
建立和實(shí)施農(nóng)產(chǎn)品的市場(chǎng)準(zhǔn)入制度是當(dāng)前的一項(xiàng)重要工作，蔬菜中農(nóng)藥殘毒的快速檢測(cè)是其中一個(gè)重要環(huán)節(jié)，作為蔬菜大省的廣東，研究用于機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥檢測(cè)的酯酶，是有效進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)、實(shí)時(shí)、大批次監(jiān)測(cè)的重要工作。這將為更深入研究該酶與有機(jī)磷農(nóng)藥的免疫分析技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、催化機(jī)制以及植物酯酶抑制法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量技術(shù)提供一定的提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。http://www.022056.cn
